Muzeum J. A. Komenského sídlí v severní části historického středu města, při městských hradbách (tzv. předsunuté opevnění města nad dnešním městským parkem).

Sestává z komplexu budov situovaných na místě bývalého zeměpanského hradu (vypálen a zbořen během třicetileté války po roce 1643). Z budov jsou nejstarší – věž s cimbuřím ze 13. století (dnešní hlavní vchod do expozic muzea se sochou Komenského od Vincence Makovského) a dvě bašty ze století 16. Jako památka je Národním památkovým ústavem evidována budova zámku, první stavba ze zamýšleného, ale nedokončeného projektu Kouniců, na jehož návrhu pracoval také známý italský architekt Domenico Martinelli (barokní sloupový sál muzeum dnes využívá k výstavám a kulturním akcím).

Muzeum bylo otevřeno v r. 1898 na základě sběratelského úsilí vzniklého u příležitosti Národopisné výstavy českoslovanské (1895), pro jejíž účely město z popudu významného českého archeologa prof. Lubora Niederleho otevřelo již v r. 1894 tzv. Národopisnou výstavku. Ve 2. pol. 20. stol. zde jako profesionální muzejníci pracovali PhDr. Jan Pavelčík, archeolog, antropolog a etnograf, a také PhDr. Josef Beneš, významný český muzeolog a etnograf. V současné době vede muzeum etnolog PhDr. Pavel Popelka, CSc.

Hlavní expozice „Jan Amos Komenský lidstvu“ seznamuje také pomocí tří audiovizuálních programů a interaktivních výstavních prvků se životem, dílem a odkazem Jana Amose Komenského (1592 – 1670). Sběratelsky hodnotná a návštěvníky často obdivovaná je dlouhodobá expozice v podkroví muzea „Starožitnosti Uherskobrodska“, v níž se lze seznámit s nejvýznamnějšími sbírkami muzea (uměleckohistorické a technické prvky měšťanské domácnosti, řemesel a způsobu života na přelomu 19. a 20. století, národopisné sbírky Uherskobrodska jako např. kroje, hudební nástroje, starobylá jizba s cennými obrázky na skle a lidovými plastikami, hospodářské nářadí aj.). Mezi nejhodnotnější díla patří interiérový nábytek z 18. století a obrazy nizozemského malíře Hamiltona. Jako kuriozity lze jmenovat např. velocipéd, rytířské brnění nebo původní sošku Černého Janka, jejíž replika dodnes vyzvání na radniční věži města a patří k symbolům Uherského Brodu.

Muzeum pořádá také množství krátkodobých výstav a vernisáží, nejrůznější kulturní akce, mezi něž již tradičně patří festival masopustních tradic v obci Strání na Uherskobrodsku „Fašank“ a nesoutěžní přehlídka muzejních videofilmů „Musaionfilm“. Tradiční významnou a reprezentativní odbornou aktivitou muzea jsou mezinárodní komeniologická kolokvia pořádaná od r. 1971. Muzeum také vydává časopis Studia Comeniana et historica, jejž rozesílá do zahraničí.

Muzeum je ve správě Ministerstva kultury České republiky, které je zároveň jeho zřizovatelem. Muzeum J. A. Komenského provozuje také stálou expozici v obci Vlčnov na Uherskobrodsku „Rolnický dům a hospodářství čp. 57“.